Comparative signature interface

Comparative signature interface can be found in the "Signature comparison" tab. Its main purpose is to show what genes are differentially expressed with age and how conservative the change of each gene is across signatures. The first columns that the user sees represent the differential expression of genes in the chosen signature (first selection menu at the left of the page). A gene's Entrez ID (clickable, is a link to NCBI for a specific gene), gene symbol (both Entrez ID and gene symbol are for mouse orthologs in all signatures), quantitative differential expression metric (logFC), it's significance before and after BH adjustment (pvalue and adjusted_pvalue) is what can be found for each gene in a selected signature.

One can filter out all the genes having less significance in the chosen signature than a threshold with the "threshold for adjusted pvalue" input. By default, all genes from the signature are shown. The presence filter is handy for filtering out the genes which are not present in a lot of signatures.

Now for the comparative part of the table. The green arrows represent that the gene is upregulated with age, and red arrows represent the downregulation of the gene. The numbers next to the arrows are the corresponding logFCs rounded to 2 decimal places (so 0 can actually be a very small up- or downregulation). Here, some cells are highlighted with green or red background. These cells correspond to a gene having a statistically significant up- or downregulation, respectively, in the corresponding signature. The user can specify two thresholds for adjusted p-value: the soft one for genes with moderate significance (default is 0.05) and the hard one for genes with high significance (default is 0.001). The genes that are more significant than the soft threshold will have lightly colored background, and those which are more significant than the hard threshold will have a brighter colored background. The genes can be filtered so that they satisfy the soft threshold in at least N signatures with a slider. One can also filter genes upregulated or downregulated in a set of signatures (selection menus at the bottom-left). These selection menus do not take into account significance, they only filter by logFC values. If several signatures are selected in them, only the intersection is displayed (genes satisfying all of the conditions).

Each cell in the right ("comparative") part of the table is clickable and will direct the user to the mixed effects model plot of the corresponding gene (table row) in the corresponding signature (table column). One can find more information on such plots in the "Gene plots" tab of the manual.

Mixed-effects model plot

The "Gene plot" tab contains plots of mixed-effects models for genes within signatures. The horizontal red line on the plot is the mixed-effects model mean logFC for the chosen gene in the chosen signature (the number displayed in the signature comparison table). Each point of the scatter plot represents mean logFC from a specific dataset from the signature in which the gene was present, with error bars showing the standard error for this dataset. The gene and signature for the plot can be chosen manually in the menus at the left of the table, or they will be set automatically when the user clicks on a cell in the right part of the signature comparison table. On hover, dataset information and exact logFC values are displayed for each point on the plot.

The "Color by:" and "Shape by:" options allow the user to tailor the plot to their needs. The default setting is to color by tissue and shape by species.

Dataset plot

Clicking on any point on the mixed-effects model plot will trigger the appearance of a dataset plot (at the bottom of the page). The dataset plot shows how the expression of the chosen gene changes across samples with different age in the dataset the clicked point corresponds to. By looking at this plot one can see where the logFC value and its standard error come from. The slope of the regression line corresponds to the logFC value, whereas the standard error (signified by the confidence interval around the line) arises from points (i.e. samples, these may be individual mice, rats or humans) being far away from the regression line. Please make note that when there are a lot of points, the confidence interval is always relatively small. On some plots there are just two ages, and in this case the horizontal lines denote the means (logFC arises from the difference of the means). On these plots the exact age of samples may not be available (e.g. they are denoted as "young" and "old").

Functional enrichment of signatures

In this section, the Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) of the signatures of aging is shown. The table is equivalent to the signature comparison section, but instead of genes there are functional groups of genes coming from four databases: GO BP (biological process section of the gene ontology database), KEGG , Reactome and Biocarta . The quantitative metric of upregulation or downregulation with age here is NES (normalized enrichment score, see full explanation of its meaning here ). Positive NES means upregulation with age, and negative NES means downregulation with age. The metric of statistical significance is BH adjusted p-value. The filters at the left of the page are also equivalent to those in the signature comparison section (all significance filters are for adjusted p-value). Additionally, there is a filter for specific databases of functional terms ("Databases for functional terms").

In this table two sections are clickable. The first one is the first column with function names. Clicking on a name will leave a table containing only functions connected to the clicked one. A connection between functions, or functional groups of genes, is defined as one functional group of genes being a subset of the other. This feature is intended to make it easier to compare enrichment scores of bigger, or "maternal" functional groups, and smaller, or "daugther" functional groups, to the scores of the clicked function. When viewing the connected functions, all the filters from the left part of the page are retained. To exit the connection view mode, one must click the "Back to full table" button under the table. The second clickable section of the table is its right part. Clicking here will transfer the user to the functional enrichment plot of the corresponding function in the corresponding signature. This feature is designed to give an explanation for where the numbers in the table are coming from.

Functional enrichment plot

In this section, the user can view GSEA enrichment of functional groups of genes at the dataset level. Clicking the right section of the functional enrichment table will result in a plot for the clicked function (row of the table) in the clicked signature (column of the table). An example bar plot is displayed above. Green bars stand for statistically significant upregulation of a function with age in a particular dataset, red bars stand for statistically significant downregulation. Grey bars are not statistically significant based on the set threshold for adjusted p-value (can be changed in the left part of the page, default is 0.05). Dataset information can be found by hovering the mouse cursor over a bar in the plot. Only the datasets from the chosen signature will be displayed (signature and function can be changed in the left part of the page as well). The datasets with NA values are not displayed. The NES score in the functional enrichment table does not necessarily have to be the mean of NESes of the datasets, but the scores of the datasets can give a rough idea of what the signature NES should be.

Download data

This section contains 3 download buttons: the first one for the table with the gene expression data, the second one for the table with the functional enrichment data and the third one for the table with dataset annotation.

The first .csv file in the Downloads section contains one big table with all of the genes and differential expression data from all of the signatures (it's tab-separated). From each signature there are three columns: logFC, pvalue and adjusted_pvalue. These columns are the actual data, whereas the rest of the columns are all derived from it and their sole purpose is to make gene filtering easier. The presence columns represent in how many signatures the gene is present (so it's a value from 0 to 3 for presence_species and presence_tissues, a value from 1 to 7 for presence_all and a value from 0 to 1 for presence_global). If a gene is not present in a signature, it gets NAs in the corresponding 3 columns. The table also has columns containing geometric means of adjusted pvalues accross the signatures of species and the signatures of tissues.

The second .csv file is analogous to the first one, but it has to do with functional enrichment. Instead of gene IDs here there are names of functional groups of genes; the quantitative enrichment metric is NES, and the statistical significance metric is BH adjusted p-value. The filtering columns are also present, they filter by adjusted p-value.

The third file contains information such as the number of samples, the age range of samples, the full name of the RNA-Seq or microarray platform for every dataset used to construct the signatures of aging.

Сравнение сигнатур

Интерфейс для сравнения сигнатур на уровне индивидуалных генов можно найти во вкладке "Сравнение сигнатур". Его основная цель - показать, какие гены дифференциально экспрессируются с возрастом и насколько консервативно изменение каждого гена по сигнатурам. Первые столбцы, которые видит пользователь, содержат информацию о дифференциальной экспрессии генов в выбранной сигнатуре (первое меню выбора слева на странице). Entrez ID гена (можно кликнуть, это ссылка на NCBI для конкретного гена), символ гена (и Entrez ID, и символ гена предназначены для ортологов мыши во всех сигнатурах), количественный показатель дифференциальной экспрессии (logFC), его значимость до и после поправки BH (pvalue и adjusted pvalue) представлены для каждого гена в выбранной сигнатуре.

Можно отфильтровать все гены, имеющие меньшую статистическую значимость в выбранной сигнатуре, чем порог, с вводом "порога для скорректированного pvalue". По умолчанию отображаются все гены из сигнатуры. Фильтр присутствия удобен для фильтрации генов, которых нет во многих сигнатурах.

Теперь о сравнительной части таблицы. Зеленые стрелки показывают, что экспрессия гена растет с возрастом, а красные стрелки означают возрастное снижение экспрессии гена. Цифры рядом со стрелками - это соответствующие logFC, округленные до 2 десятичных знаков (так что 0 на самом деле может быть очень маленьким положительным или отрицательным значением). Здесь некоторые ячейки выделены зеленым или красным фоном. Эти клетки соответствуют гену, имеющему статистически значимое увеличение или уменьшение экспрессии, соответственно, в соответствующей сигнатуре. Пользователь может указать два порога для adjusted p-value: мягкий для генов со средней значимостью (по умолчанию 0,05) и жесткий для генов с высокой значимостью (по умолчанию 0,001). Гены, которые более значимы, чем мягкий порог, будут иметь светлый фон, а те, которые более значимы, чем жесткий порог, будут иметь более яркий фон. Гены можно фильтровать так, чтобы они удовлетворяли мягкому порогу по крайней мере в N сигнатурах с помощью ползунка. Можно также фильтровать гены с возрастным увеличением или уменьшением экспрессии в наборе сигнатур (меню выбора в нижнем левом углу). Эти меню выбора не учитывают значимость, они фильтруют гены только по значениям logFC. Если в них выделено несколько сигнатур, отображается только пересечение (гены, удовлетворяющие всем условиям).

Каждая ячейка в правой (сравнительной) части таблицы является активной, и клик на нее направляет пользователя к графику модели смешанных эффектов соответствующего гена (строка таблицы) в соответствующей сигнатуре (столбец таблицы). Более подробную информацию о таких графиках можно найти во вкладке руководства "Графики для отдельных генов" .

График модели смешанных эффектов

Вкладка "Графики для отдельных генов" содержит график модели смешанных эффектов для генов в сигнатурах. Горизонтальная красная линия на графике показывает средневзвешенное значение logFC модели смешанных эффектов для выбранного гена в выбранной сигнатуре (число, отображаемое в таблице сравнения сигнатур). Каждая точка на графике показывает значение logFC из определенного набора данных, взятого для построения выбранной сигнатуры, с доверительным интервалом, показывающим одну стандартную ошибку для этого набора данных. Ген и сигнатуру для графика можно выбрать вручную в меню слева от таблицы, или они будут установлены автоматически, когда пользователь кликнет на ячейку в правой части таблицы сравнения сигнатур. При наведении указателя мыши информация о наборе данных и точные значения logFC отображаются для каждой точки на графике.

Параметры "Окраска:" и "Форма точек:" позволяют пользователю адаптировать график под свою задачу. По умолчанию используется окраска по тканям, а форма точек показывает биологический вид.

График экспрессии для отдельного набора данных

Клик по любой точке на графике модели смешанных эффектов вызовет появление графика для отдельного набора данных (внизу страницы). Данный график показывает, как изменяется экспрессия выбранного гена с возрастом в наборе данных, которому соответствует точка, на которую щелкнули мышью. Глядя на этот график, можно увидеть, откуда берутся значение logFC и его стандартная ошибка. Наклон линии регрессии соответствует значению logFC, тогда как стандартная ошибка (обозначенная доверительным интервалом вокруг линии) возникает из-за точек (т.е. образцов, это могут быть отдельные мыши, крысы или люди), находящихся далеко от линии регрессии. Обратите внимание, что при большом количестве точек доверительный интервал всегда относительно невелик. На некоторых графиках указано всего два возраста, и в этом случае горизонтальные линии обозначают средние значения (logFC возникает из разницы средних). На этих графиках точный возраст образцов может быть не указан (например, они могут быть обозначены как "молодые" и "старые").

Функциональное обогащение сигнатур

В этом разделе показано функциональное обогащение (англ. Gene Set Enrichment Analysis, GSEA) сигнатур старения. Таблица эквивалентна разделу сравнения сигнатур, но вместо генов здесь представлены функциональные группы генов из четырех баз данных: GO BP (раздел "biological process" базы данных Gene Ontology), KEGG , Reactome и Biocarta . Количественным показателем усиления или подавления экспрессии с возрастом здесь является NES (нормализованная оценка обогащения, см. полное объяснение ее значения здесь ). Положительный NES означает усиление экспрессии с возрастом, а отрицательный NES означает подавление с возрастом. Показатель статистической значимости - BH adjusted p-value. Фильтры в левой части страницы также эквивалентны фильтрам в разделе сравнения сигнатур (все фильтры на статистическую значимость здесь применяются к adjusted p-value). В дополнение к ним здесь имеется фильтр баз данных для функциональных групп генов ("Базы данных функций генов").

Здесь можно кликнуть на две части таблицы. Первая из них - это первый столбец с названиями функций. Клик по названию возвращает таблицу, содержащую только функции, связанные с выбранной. Связь между функциями, или функциональными группами генов, присутствует, когда одна функциональная группа генов является подмножеством другой. Возможность подобной фильтрации предназначена для упрощения сравнения показателей обогащения более крупных, или "материнских", функциональных групп и меньших, или "дочерних", функциональных групп со значением функции, по которой щелкнули мышью. При просмотре материнских и дочерних функций все фильтры из левой части страницы сохраняются. Чтобы выйти из режима просмотра связанных функций, необходимо нажать кнопку "Вернуться к полной таблице" под таблицей. Второй раздел таблицы, на который можно кликнуть, - это ее правая часть. Щелчок мышью здесь переведет пользователя на график функционального обогащения соответствующей функции в соответствующей сигнатуре (вкладка "Графики для отдельных функций"). Эта возможность предназначена для объяснения того, откуда берутся значения NES в таблице.

Графики для отдельных функций

В этом разделе пользователь может просмотреть обогащение GSEA для конкретной функциональной группы генов на уровне отдельных наборов данных. Клик по правой части таблицы функционального обогащения приведет к появлению графика для выбранной функции (строка таблицы) в сигнатуре, по которой кликнули (столбец таблицы). Пример столбчатой диаграммы показан выше. Зеленые столбцы обозначают статистически значимое повышение экспрессии с возрастом в конкретном наборе данных, красные столбцы обозначают статистически значимое понижение экспрессии. Серые полосы не являются статистически значимыми на основе установленного порога для скорректированного p-value (можно изменить в левой части страницы, по умолчанию 0,05). Информацию о наборе данных можно найти, наведя курсор мыши на столбец на графике. Будут отображаться только наборы данных из выбранной сигнатуры (сигнатуру и функцию также можно изменить в левой части страницы). Наборы данных со значениями NA не отображаются. Оценка NES в таблице функционального обогащения не обязательно должна быть средним значением NES соответствующих наборов данных, но оценки наборов данных могут дать приблизительное представление о том, какой должен быть NES в сигнатуре.

Скачать данные

Этот раздел содержит 3 кнопки для скачивания: первая для таблицы с данными экспрессии генов, вторая для таблицы с данными функционального обогащения, а третья для таблицы с аннотацией всех использованных наборов данных.

Первый файл .csv в разделе "Скачать данные" содержит одну большую таблицу со всеми генами и данными дифференциальной экспрессии из всех сигнатур (они разделены табуляцией). Для каждой сигнатуры есть три столбца: logFC, pvalue и adjusted_pvalue. Эти столбцы представляют собой сами данные, тогда как остальные столбцы являются производными от них, и их единственная цель - упростить фильтрацию генов. Столбцы присутствия показывают, во скольких сигнатурах присутствует ген (таким образом, это значение от 0 до 3 для presence_species (виды) и presence_tissues (ткани), значение от 1 до 7 для presence_all (все сигнатуры) и значение от 0 до 1 для presence_global (глобальная сигнатура)). Если ген отсутствует в сигнатуре, он получает NA в соответствующих 3 столбцах с данными дифференциальной экспрессии. В таблице также есть столбцы, содержащие геометрические средние скорректированных p-value по сигнатурам видов и сигнатурам тканей.

Второй файл .csv аналогичен первому, но содержит данные по функциональному обогащению. Вместо идентификаторов генов здесь названия функциональных групп генов; количественная метрика обогащения - NES, и метрика статистической значимости - BH adjusted p-value. Столбцы фильтрации также присутствуют, они фильтруют по adjusted p-value.

Третий файл содержит информацию про каждый набор данных, который был использован для создания сигнатур старения: количество образцов, диапазон возрастов, полное название платформы секвенирования или микрочипа и пр.